1.背景过高
(1)检查一抗的浓度是否过高，适当降低浓度
(2)确保封闭液有效，可更换封闭液或延长封闭时间
(3)一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜结合
(4)曝光时间过长时，适当缩短曝光时间
(5)检查二抗的浓度，如果二抗的浓度过高，也会导致背景过高，适当降低二抗的浓度
2.条带模糊
(1)检查蛋白样品的浓度，确保蛋白样品的浓度均匀且足量
(2)蛋白转印过程中，转移不完全或过转移，可适当调整转膜的时间和电流
(3)一抗孵育时间不够，建议4℃过夜结合
(4)二抗与一抗不匹配，需选择针对一抗来源的种属的抗体
(5)检查电泳过程中的温度，如果温度过高，降低电泳的电压，或者在电泳过程中加入冰块降低温度
3.条带缺失
(1)检查蛋白构建是否正确，并选择表达量高的阳性对照
(2)检查蛋白表达量是否过低，增加上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂
(3)确保蛋白样品保存条件稳定
(4)检查一抗和二抗，是否是正确的，是否能够识别测试种属的蛋白
(5)检查一抗和二抗的浓度，如果一抗的浓度过低，需要适当增加一抗的浓度
4.条带不好看
(1)凝胶混合液混合不均匀，在制备蛋白胶时应充分混匀再加入胶板
(2)拔掉齿梳时，点样孔扭曲，上样量不均匀
(3)缓冲液反复使用时，成分可能改变，建议更换新鲜缓冲液
5.非特异性条带
(1)目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等)，本身可以呈现多条带
(2)目的蛋白有其它剪切本，可查阅文献或生物信息学分析可能性
(3)样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂，样本处理时在冰上操作
(4)上样量过高，太敏感，适当减少上样量
(5)一抗或者二抗浓度偏高，降低抗体浓度
(6)抗体特异性不强，选择特异性强的抗体
(7)抗体孵育时间过长，显色曝光时间过长
6.条带强度不一致
(1)抗体和蛋白质结合效率不一致，可调整抗体的浓度和反应的时间
(2)蛋白质浓度不一致，可优化蛋白质的提取和浓度测定方法
7.条带中间出现白斑点
底物消耗过快，中间区底物消耗完不发光。可降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度，或快速操作，在中间部位底物消耗之前就把胶光片定影出来
8、膜上出现黑点
(1)膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合，封闭用的牛奶一定要完全溶解
(2)封闭后至少洗膜一次，确定封闭牛奶完全溶解，否则封闭时会导致不溶性颗粒附着在膜上
(3)在牛奶溶解之后静止三分钟，轻取上层牛奶液进行封闭，封闭结束常规洗膜一次
(4)孵育一抗或二抗时，需要加牛奶稀释时也参照此操作
9.条带拖尾
(1)蛋白量太大，根据实验需求调整上样蛋白量
(2)一抗浓度偏高，做预实验避免，根据产品说明书的稀释比例进行优化
(3)孵育时间太长，调整一抗孵育时间，根据实际情况选择37℃孵育半小时或4℃孵育过夜等，洗膜次数和频率到位
10.微笑条带
电泳条带或整体出现 “︶ ”形状
(1)如果电泳速度过快，需通过降低电压减慢电泳速度
(2)电泳温度过高，使得胶变形，可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH
11、皱眉条带
与微笑状条带相反，条带成现“︵”皱眉状
(1)装置不合适
(2)凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全
12.哑铃状条带
条带出现中间细两边粗，呈现哑铃状
(1)配置胶有问题，胶凝固后不均一，可通过重新配置胶，确保胶质量无问题来避免该现象出现
(2)样品可能含有过多杂质，在样品使用前对其进行离心，以去除过多杂质
13.条带粘连
不同孔目标条带连在一起，中间无间隔
(1)上样量太多，可减少上样量
(2)制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔，可提高配胶质量
联系我们
关注我们
