IHC常见染色问题和解决方法

结果阴性

抗原丢失：组织处理不当，如过度固定、脱水或热处理，可以破坏抗原表位，导致抗体无法识别。确保使用适合特定抗原的固定和处理方法。

抗体问题：使用了无效、低亲和力或非特异性抗体。选择经过充分验证、具有高特异性和亲和力的抗体至关重要。

抗原修复不足：某些抗原需要特定的抗原修复步骤才能暴露其表位。缺乏或不适当的抗原修复可能导致抗体无法结合。换修复液或加强修复，优化抗原修复条件。

检测系统故障：包括酶标记物、底物或显色剂的失效。确保所有试剂在使用前都是有效的，并按照制造商的指南操作。

样本问题：样本可能不含目标抗原，或者抗原表达水平极低，不足以被检测到。使用已知表达目标抗原的阳性对照进行比较。

实验操作错误：包括样本污染、不充分的洗涤步骤、抗体浓度过低、血清封闭时间过长、DAB孵育时间过短、细胞通透不全抗体未能充分进入胞内参与反应等。

信号检测阈值设置过高：在定量或半定量分析中，信号检测阈值设置过高可能使真实的低水平表达被误判为阴性。根据样本和实验目的合理调整检测阈值。

非特异性染色（着色一片黄/背景过深）

抗体交叉反应：抗体可能与样本中的多个抗原或非特异性结构结合，导致非特异性染色。选择高特异性的抗体，进行预吸收或使用竞争抑制实验可以减少这一问题。

抗体浓度过高：过量的抗体增加了非特异性结合的机会。优化抗体浓度至最佳范围，通常需要通过预实验来确定。

样本处理不当：过度固定、脱水或样本处理过程中使用的溶剂可能暴露出额外的结合位点，促进非特异性结合。优化样本处理步骤，使用温和的固定剂，并避免过度处理。

洗涤不充分：不充分的洗涤步骤无法有效去除未结合的抗体或标记物，导致非特异性染色。增加洗涤次数或延长洗涤时间可以改善这一问题。

检测系统敏感度过高：过于敏感的检测系统可能会放大非特异性信号。调整检测系统或信号放大步骤的敏感度，以减少非特异性染色。

内源性酶活性：在使用酶标记抗体的检测系统中，内源性酶（如过氧化物酶）的活性可能引起非特异性染色。使用内源性酶抑制剂或进行酶失活步骤可以减少这一影响。

样本背景复杂：高背景样本可能含有多种潜在的结合位点，增加非特异性染色的可能性。使用封闭步骤（如血清或蛋白封闭液）可以减少背景染色。

假阳性

一抗浓度及一抗是否失效，抗体有一个合适的浓度范围且必须在有效期内使用，过期的抗体或者不着色，或者背景着色，形成假阳性

试剂未充分覆盖组织，组织边缘的试剂易干浓度较组织中间高致深染

抗体孵育时间过长，由于室温的影响夏季孵育时间稍短，冬季孵育时间稍长

操作过程中组织变干，造成组织边缘收缩或损坏形成伪影，产生假阳性

DAB显色时间太长，DAB宜现配现用，配制时间最好在30min以内

由于胞浆里含有较多的蛋白质，因此间质和胞浆中出现很多非特异性的染色，如内源性酶血红蛋白、肌红蛋白等造成的着色，可以通过血清封闭解决;乳腺癌组织中的脂肪细胞、淋巴细胞也会产生非特异性的染色

非特异性抗体吸附常见于坏死组织中，使坏死组织呈较高的背景染色，在免疫组化中应避免选择坏死组织较多的蜡块。

PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；

弱阳性

固定方式不当或固定时温度过高，影响到抗原的数量和质量；

不适当的抗原修复方式，抗原决定簇暴露不足；

抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足；

孵育抗体前切片上遗留了过多的冲洗液；

孵育时切片未放置水平，导致抗体孵育不均匀。

染色不均匀

样本制备不一致：切片厚度不均或样本固定条件的差异，导致染色剂在样本上的分布不均匀。

抗体分布不均：抗体溶液在样本上的覆盖不均匀，或在孵育过程中未能充分渗透到样本的所有区域。

抗原修复不充分：抗原修复条件（如温度、时间）不一致，导致某些区域的抗原表位未充分暴露。

洗涤步骤不彻底：残留的未结合抗体或标记物可能在某些区域积聚，导致染色过深。

显色剂应用不均：显色剂在样本上的分布不均，或显色反应时间的不一致。

样本内部结构差异：样本内部结构的差异（如细胞密度、组织类型）可能导致染色剂在不同区域的反应性不同。