【佰乐博流式小课堂】流式实验中的黄金三角 - 阳性、阴性、同型对照抗体

发表时间：2024-08-28 访问次数：48

前言

对照实验，或者对照组，是所有生物医学类实验中最重要的组成部分，决定最终实验数据有无统计学显著意义。特别是在流式等实验中，阳性对照、阴性对照和同型对照三组重要的实验设计直接关于科学实验的成败。AntibodySystem公司拥有卓越的供应链和最全面的产品线，是科研者赖以信任的抗体供应商，提供一系列流式实验相关抗体。本文以流式实验为背景带您深入探讨阳性、阴性、同型对照抗体这三类对照抗体的作用。

阴性对照

阴性对照：指一般按照当前的实验方案一定不会得到正面结果的对照实验，和阳性实验组相对。

在流式实验中，由于存在光信号叠加，因此在分析流式结果时我们需要比较荧光信号与细胞的非特异性荧光。如果得到的荧光信号大于非特异性荧光，说明得到的荧光信号部分来源于荧光素的特异性荧光，就可以得出细胞表达相应的抗原分子的结论。所以，确定与荧光素无关的细胞自身的非特异性荧光的强弱非常重要，设立阴性对照就是为了排除细胞自发非特异性荧光的干扰。

上图为3类阴性对照和标记荧光素偶联抗体(抗CD69-PE)得到的荧光信号的示意图。

通过减去3类阴性组的荧光背景强度，可以得出这群样品细胞中有30％的细胞表达有CD69抗原分子。如果没有阴性对照作为参照，直接根据最后标记荧光素偶联抗体组的荧光信号无法判断样品细胞中有多少比例的细胞表面结合有PE荧光素，从而也就无法判断有多少比例的细胞表达CD69抗原分子。

第1类negative

“negative”表示的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，因为没有标记任何荧光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号；

第2类抗CD69

“抗CD69”表示的是用抗CD69抗体标记样品细胞后得到的荧光信号，虽然抗CD69抗体能够与细胞表面的CD69抗原分子结合，但是抗CD69抗体没有偶联荧光素，所以得到的荧光信号也与细胞表面是否表达有CD69分子无关，得到的荧光信号代表的也只是细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除抗体的影响；

第3类IgG1-PE

“IgG1-PE”表示的是标记与抗CD69抗体同种属（来源于同一物种）且同类（抗CD69-PE中的抗体是IgG1类的）的非特异性抗体（IgG1）与PE荧光素偶联的同型（isotype）对照抗体（IgG1-PE）后，得到的荧光信号，这种同型对照抗体不能与细胞表面的CD69发生特异性结合，所以细胞表面不会结合有IgG1-PE，最后得到的荧光信号不是PE荧光素产生的特异性荧光信号，而是代表细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除荧光素的影响。第3类同型对照抗体就是我们在流式实验中最常设置的同型对照。

阳性对照

相比于阴性对照，阳性对照一般一定能得到预期结果，常用于实验组的效果参照。流式实验的阳性对照可用于检测某种荧光素偶联抗体是否有效。

阳性对照并不是每次流式分析时都必须设置，以下是需要设置阳性对照的情况，给大家参考判断：

1. 使用新的荧光素偶联抗体时，该荧光素偶联抗体以前没有使用过。

2. 换用不同公司的或者同一公司但不同批号的荧光素偶联抗体时。

3. 使用储存时间较长的荧光素偶联抗体时。

当出现以上三种情况时，荧光素偶联抗体会因为失效而导致无法与抗原分子结合产生特异性的荧光信号，从而得到一个假阴性的结果。

设置阳性对照通常我们使用以下两种方法：

a.选择表达目标抗原分子的样品细胞来检测，如检测荧光素（不管哪种荧光素）偶联的抗小鼠CD4抗体，可以用该抗体标记正常小鼠的脾脏细胞，因为该细胞内肯定有CD4阳性细胞，而且已知CD4阳性细胞占脾脏细胞的大致比例范围，所以如果用该抗体标记脾脏细胞得到预期结果时，就可以认为该抗体有效；

b.选择偶联不同荧光素的单克隆抗体来检测，如需检测FITC偶联的抗小鼠CD4抗体（FITC-CD4抗体）是否有效，实验室已有证明有效的PE偶联的抗小鼠CD4抗体（PE-CD4抗体），这时可以用这两种荧光素偶联抗体同时标记同一份肯定表达有相抗原分子（CD4分子）的样品细胞，流式检测后如果PE阳性的细胞FITC也是阳性的，PE阴性的细胞FITC也是阴性的，就可以证明该待测的荧光素偶联抗体有效。

同型对照

在阴性对照中我们引出一个新的概念:同型对照，其作用是排除非特异性结合

a.抗体与靶细胞上的 Fc 受体结合

b.抗体与细胞蛋白、碳水化合物和脂类的非特异性结合。

一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体。

如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。

如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同——亚型不同——相同类别。

例如:某种的抗体的来源是Mouse IgG2a。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记Mouse IgG2a为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2a，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b，那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。

分析流式结果时，不能因为得到了荧光信号就判断细胞表面肯定结合有相应的荧光素，从而得出细胞表达相应的抗原分子的结论，而应该比较该荧光信号与细胞的非特异性荧光，如果得到的荧光信号大于非特异性荧光，说明得到的荧光信号部分来源于荧光素的特异性荧光，就可以得出细胞表达相应的抗原分子的结论。

什么时候需要使用同型对照？

（1）对流式不是非常熟悉的客户。

（2）做胞内流式客户，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。

（3）使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户，因为客户不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。

（4）一些特异性不高的抗体，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性。

为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？

首先检查同型对照抗体类型是够正确、使用是否过量。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。

AntibodySystem Laboratories SAS是由ProteoGenix于2019年创立的独立品牌，专注于生命科学研究领域蛋白及抗体试剂研发生产。致力于为全球生命科学基础研究者提供高质量的蛋白，抗体产品，产品类别囊括传统多抗，经典内参抗体，标签抗体，高活性蛋白，invivo功能性抗体，低背景流式抗体，高特异性纳米抗体，特色小分子抗体，高质量磷酸化抗体，DNA/RNA抗体,PEG抗体等十余个系列;目前AntibodySystem旗下产品线涵盖48种病毒与超级细菌，寄生虫，肿瘤，老年痴呆，帕金森，变态与过敏反应，免疫抑制与免疫激活等多个领域。AntibodySystem Laboratories SAS团队开发出一系列高品质流式抗体，针对经典克隆号，以常规膜蛋白流式抗体为主，覆盖全系热门靶点。