佰乐博生物常见问题-蛋白质浓度测定方法（一）

应用：紫外分光光度法适用于初步筛选和快速测定蛋白质样品的浓度，尤其适合那些含有高比例酪氨酸、色氨酸的蛋白质。该方法操作简单，无需额外试剂，且检测速度快，因此在实验室中被广泛使用。然而，该方法也有局限性，比如对于不含或含有少量芳香族氨基酸的蛋白质，其准确性会大大降低。此外，样品中的其他物质如核酸、酚类化合物等在280nm处也有吸收，可能对蛋白质的测定造成干扰。

操作步骤：

a. 样品准备：将蛋白质样品稀释至适当的浓度，以确保吸光度值在仪器的线性范围内。

b. 仪器校准：使用纯水或适当的缓冲液作为空白对照，校准紫外分光光度计。

c. 吸光度测量：将样品置于比色皿中，放入紫外分光光度计的样品室，在280nm波长下测量吸光度。

d. 数据处理：记录吸光度值，根据标准曲线或已知的蛋白质摩尔吸光系数，计算蛋白质的浓度。

e.结果分析：根据计算出的蛋白质浓度，评估样品的纯度和浓度，以决定是否需要进一步纯化或调整实验条件

*注意事项

确保样品中没有核酸污染，因为核酸在260nm和280nm处也有吸收，可能影响蛋白质浓度的测定。对于含有大量还原性物质的样品，应先进行适当的预处理，以避免对测量结果的干扰。选择合适的比色皿和光程，以确保吸光度值在0.1至1.0之间，保证测量的准确性和线性。

原理：BCA法(Bicinchoninic Acid Assay)是一种广泛用于测定蛋白质浓度的高灵敏度方法，尤其适用于含有高浓度还原剂如巯基化合物的样品。BCA法基于蛋白质与铜离子(Cu2+)的结合反应。在碱性条件下，蛋白质中的氨基酸残基，尤其是含硫的半胱氨酸和甲硫氨酸，可以还原Cu2+至Cu+。随后，Cu+与BCA试剂中的双环己酮草酸反应，形成稳定的、紫色的复合物。这一复合物在562nm波长下有强烈的吸收，其吸光度与蛋白质浓度成正比，因此可以通过测量吸光度来定量蛋白质的浓度。

实验步骤：

a. 样品准备：将待测样品稀释至适当的浓度，确保吸光度值在BCA法的线性范围内。

b. BCA工作液制备：将BCA试剂A(含有BCA和NaOH)和BCA试剂B(含有CuSO4)按照特定比例混合，制备成BCA工作液。

c. 标准曲线制备：使用已知浓度的标准蛋白质溶液，按照实验步骤制备标准曲线，用于后续的蛋白质浓度计算。

d. 样品测定：在96孔板中，向每个孔中加入样品或标准蛋白质溶液，然后加入等量的BCA工作液，充分混匀。

e. 温育：将96孔板置于56℃水浴中温育30分钟，以促进蛋白质与Cu2+的结合反应。

f. 冷却：温育后，将96孔板冷却至室温。

g. 吸光度测量：使用分光光度计在562nm波长下测量每个孔的吸光度。

h. 结果分析：根据标准曲线，通过样品的吸光度值计算蛋白质的浓度。

*注意事项：在实验过程中，应避免BCA试剂与皮肤和眼睛接触，因为它可能具有一定的刺激性。为确保实验的准确性和可重复性，所有样品和标准蛋白质溶液的处理应尽量保持一致。温育时间和温度对BCA反应的影响较大，应严格按照实验方案进行。