Science解读：一种新的呼吸道合胞病毒RSV三聚体融合前构象(pre-F)的构建方法

        呼吸道合胞病毒 (RSV) 是一种高度传染的病原体，可能导致儿童、老年人和免疫功能低下人群发生严重的呼吸道疾病。呼吸道合胞病毒 (RSV) 表面的融合糖蛋白F介导病毒进入宿主细胞，是人体血清中中和抗体的主要靶标，因此成为疫苗开发的理想抗原。呼吸道合胞病毒 (RSV) F蛋白存在两种构象：融合前构象（pre-F）和融合后构象（post-F）。大多数中和抗体主要针对不稳定的融合前构象，但是融合前构象容易转变为更稳定的融合后构象。因此，将呼吸道合胞病毒 (RSV)  F蛋白锁定在融合前构象是一种有前景的疫苗设计策略。

        2023年5月3日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了葛兰素史克（GSK）开发的全球首个呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗“Arexvy”。该疫苗通过在F蛋白C末端引入两个点突变（S155C和S290C），促使其形成二硫键，同时填充蛋白构象上的空腔以增加其稳定性，从而形成稳定的融合前构象三聚体，命名为DS-Cav1。该疫苗专为60岁及以上人群设计，标志着全球首个RSV疫苗成功上市。

        2024年9月27日，Science发表了中国生物研究院的科研论文，通过在F蛋白的α1和α5和三聚体接触面引入点突变，使呼吸道合胞病毒融合蛋白F形成稳定的三聚体pre-F构象。

        呼吸道合胞病毒融合蛋白F表达出来以F0的前体形式存在，经过furin酶切后形成F1、F2和p27三段，F1和F2通过内部两对二硫键连接，最后组装成三聚体。F蛋白从pre-F构象向post-F构象转变时RR1和RR2结构域发生结构重排。通过结构生物学和生物信息学分析发现，α1和α5区对变构起重要作用。

图1. 呼吸道合胞病毒融合蛋白F的结构

        基于以上分析，研究人通过突变引入二硫键，单点和双点突变引入疏水氨基酸共设计了68条突变序列。采用HEK293瞬时转染表达，用AM14 (识别呼吸道合胞病毒融合蛋白F的三聚体pre-F构象)单克隆抗体检测培养基上清，发现所有5个引入二硫键的突变体，16个单点突变和5个双点突变的表达上清均有很高的AM14结合活性。但是他们发现纯化后的DM-9(N227M, L230F)的D25的结合能力与DS-Cav1相当，与AM14的结合活性下降明显。说明DM-9能够维持稳定的pre-F构象，但是不能很好地形成三聚体。

图2. 培养基上清对AM14有高亲和力，但纯化后亲和力降低

        为了稳定三聚体pre-F构象，研究人员在DM-9的基础上对三聚体相互作用界面上的氨基酸做点突变。与野生型和DM-9相比，纯化得到的蛋白对AM14和D25的结合力都有提升，且与DS-Cav1相当，说明S509F突变使三聚体结构更稳定，这一结果也得到了冷冻电镜结构的印证。

图3. 第二轮突变后，纯化得到的RSV-preF对AM14和D25都有高亲和力

        动物实验显示，TriM-5（N227M/L230F/S509F）具有很好的免疫效果。接种两剂TriM-5后的棉鼠三周后的攻毒实验显示，与对照组相比，接种TriM-5的棉鼠和接种DS-Cav1的棉鼠体重没有明显下降，肺部感染也非常轻微。

图4. 攻毒实验显示接种两剂量TriM-5对棉鼠有很好的保护效果

        这篇文章介绍了一种新的稳定呼吸道合胞病毒（RSV）三聚体 pre-F构象的新方法，为新的呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗开发提供新的思路。

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