蛋白互作常见应用之——表面等离子共振（SPR）

前两期和科研宝子们分享了co-IP实验和GST-Pull down实验，这一期小编带大家了解另一种常见的互作实验——SPR。表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术凭借其无标记、实时监控、高灵敏度等特点，在过去数十年里迅速崛起，成为探究蛋白质、核酸、小分子药物等生物大分子相互作用的强大工具。

原理

表面等离子共振是一种光学现象，发生于金属薄膜与介质界面处，当入射光的波长、角度和偏振方向满足特定条件时，可激发金属表面电子集体振动形成等离子体波，进而引起光的反射系数急剧下降的现象。在生物传感应用中，金属（通常是金或银）膜沉积在玻璃基底上作为感应元件，生物分子通过化学偶联或物理吸附的方式固定于金属膜表面，形成生物传感器芯片。当流动池中含有所需检测物质的溶液流过芯片表面时，如果存在相互作用，则该物质将结合到固定的配体上，导致局部折射率发生变化，从而影响SPR角或SPR信号强度。通过监测这种变化，即可实现对分子相互作用的定性和定量分析。

在SPR传感器芯片的金膜表面发生的现象如下：

入射光角调谐：当单色光源的光线以一定的角度照射至玻璃基底上的薄金层时，会发生全内反射。此时，光的能量会在金膜和介质界面处激发表面等离子体波。

表面等离子体形成：当入射光的角度恰好满足特定条件时，光能量与自由电子在金膜表面上的集体振荡——表面等离子体——耦合，形成强烈的共振，称为SPR角。这时，反射光强度急剧下降，在特定角度达到最低点。

生物分子相互作用监测：在金膜表面固定某种生物分子（如抗体、DNA探针等）作为“生物识别元件”。当含有相应配体的流体通过时，如果存在相互作用，则会引起局部折射率的变化，进而改变SPR角的位置。由于SPR信号对折射率极其敏感，即使是非常微小的折射率变化也能够被精准探测到，因此能够实现实时监控分子间的结合和解离过程。

SPR的优势

1. 实时监测：无需添加任何标记物，能够直接观察到分子结合与解离的过程。
2. 高灵敏度：可探测到纳摩尔甚至皮摩尔级别的分子浓度变化，适用于极微量样品的研究。
3. 动态信息丰富：不仅能判断是否发生相互作用，还能提供结合速率常数、解离速率常数和平衡结合常数等动力学参数。
4. 广泛的适用对象：几乎涵盖所有类型的生物分子，包括但不限于蛋白质、抗体、核酸、糖类、脂质和小分子化合物。

实验步骤

1. 明确实验意图：如测定结合亲和力（Kd）、动力学参数（kon, koff）或是筛选配体。

2. 选择传感器芯片：根据待测分子性质（如蛋白质、核酸等），选择合适类型的SPR芯片，例如CM5、Series S等。

3. 激活芯片表面：使用EDC/NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）等试剂激活芯片表面羧基，为后续共价偶联提供活性位点。

4. 偶联生物分子：将“配体”（通常是抗体、蛋白质或其他生物大分子）共价连接到芯片表面。此步需精细调节，确保捕获分子正确定向，提高后续检测效率。

5. 封闭剩余活性位点：使用乙醇胺等试剂封端，阻止非特异性吸附。

6. 流动单元设置：SPR仪器通常具备多个流动通道，其中一个用于空白参照，其他则用于不同浓度的样品检测。

7. 参考流动单元校准：使用不含目标分子的溶剂冲洗，记录背景信号，用于数据处理时扣除。

8. 注射样品：依次注射含不同浓度目标分子的样品，观察SPR响应单位（RU）的变化，记录结合和解离过程。

9. 实时数据记录：仪器软件自动记录每个时间点的RU值，形成结合曲线。

10. 数据拟合与计算：运用专业软件（如BIAevaluation）拟合数据，解析出结合动力学参数（kon, koff）及亲和力（Kd）。

11. 质量控制检查：评估每批实验的重复性和稳定性，确保数据可靠性。

12. 数据分析：深入解读动力学参数的意义，探讨分子间相互作用机制。

应用实例

药物发现与开发：评估药物候选分子与靶蛋白的结合能力，预测药效和毒性。

疾病标志物筛选：识别血液、尿液等生物样本中异常水平的生物标志物，辅助早期诊断和病情监控。

免疫学研究：量化抗体-抗原相互作用强度，揭示免疫应答机制。

分子进化：监测蛋白质工程改造前后性能指标的变化，指导定向进化策略的实施。

注意事项

1. 实验条件一致性：确保温度、pH值、流速等实验条件在整个实验过程中一致，以减少突变。
2. 清洁维护：定期清洁SPR仪器，特别是流路系统，避免交叉污染。

下期小编将带大家了解另外一种蛋白互作的实验应用——BLI，敬请期待吧！