外周血单个核细胞（PBMC）分离操作指南

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）的分离是许多免疫学、肿瘤学及相关研究的基础步骤。PBMC主要由T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和单核细胞等组成，这些细胞在外周血中占据重要比例。其分离通常采用密度梯度离心法，该方法能够高效地从外周血中分离出PBMC，用于后续的实验操作。以下介绍一种标准的PBMC分离流程，并推荐一些常用试剂的货号。

Fig 1. Isolation of PBMCs

制备流程概述
样本准备
收集抗凝剂处理的外周血样本，常用的抗凝剂为EDTA。推荐使用BD Vacutainer® EDTA 血采管 (货号：367856) 以确保样本稳定性。

稀释血样
将收集的血样按1:1比例稀释于无菌的平衡盐溶液（D-PBS或RPMI 1640）。Gibco™ DPBS (货号：14190144) 或 Gibco™ RPMI 1640 Medium (货号：11875093) 是常用的选择。

密度梯度离心
在15 ml离心管中加入等体积的Ficoll-Paque密度梯度介质（推荐使用GE Healthcare Ficoll-Paque PLUS (货号：17-1440-02)），然后小心地将稀释后的血液层叠于密度梯度介质上，确保界面清晰。

离心
在室温下以400 g的离心力，进行30分钟的离心。注意不要使用制动功能，以免扰乱PBMC层。

分离PBMC
离心结束后，PBMC会形成一层白色的雾状环，位于等密度液体的上方。使用巴斯德吸管小心地吸取PBMC层，并转移到新的离心管中。

洗涤PBMC
用平衡盐溶液（如D-PBS）洗涤PBMC两次，随后通过离心（300 g，10分钟）去除Ficoll残留物和血浆成分。

细胞计数与存活检测
通过台盼蓝染色法检测细胞活力。推荐使用Trypan Blue Stain (货号：15250061) 来评估PBMC存活率。

PBMC保存
分离出的PBMC可用于即刻实验或进行冷冻保存。冷冻时，建议使用Gibco™ Recovery™ Cell Culture Freezing Medium (货号：12648010)，这是一种专为PBMC保存设计的培养基，能够确保细胞的长期存活率。