流式抗体的选择：从基础知识到实践技巧

发表时间：2024-09-25 访问次数：33

流式细胞术（Flow Cytometry, FC）是一种以流式细胞仪为检测手段，在悬浮液中快速分析和分类单个细胞或细胞结构，并加以定量的技术。结合了光学和电子测量手段，通过对细胞进行荧光染色，实现了对细胞特征，如大小、形状和荧光信号的即时量化。流式细胞术还可以结合细胞分选仪通过荧光激活细胞分选（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）精准的从群体种分离特定类型的细胞或细胞器，极大地推动了细胞生物学、免疫学以及临床诊断等多个领域的进步。

特点：

研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、人工合成微球等；
快速、准确、高通量检测；
多参数、多荧光分析，对细胞特性的识别、计数更为准确；
定性或定量分析细胞；
分选特定性状或功能的细胞

流式细胞仪分类：

1. 传统流式细胞仪：

2. 质谱流式细胞仪：

3. 光谱流式细胞仪：

下面先以最常用的传统流式细胞仪进行介绍和了解：

市面上常见的流式细胞仪厂家有：BD、Beckman、Agilent、美天旎等

BD常见仪器：

Beckman常见仪器：

Agilent常见仪器：

美天旎常见仪器：

接下来让我们了解一下流式细胞仪的工作原理，仪器一般包括四个系统：

1. 流动室与液流系统

流动室是流式细胞仪的心脏，样品（通常是悬浮在液体中的细胞）被高压泵推入喷嘴形成一股稳定的液流。在流动室内，样品被约束成一条狭窄且均匀的液流束，称为鞘液流（sheath flow），这样可以确保每个细胞逐一经过检测点，避免相互干扰，便于精确测量。

2. 光源与光学系统

光源通常为激光器，产生高强度的单色光束。当液流束通过光源时，细胞或颗粒会被照射并散射光线，或者荧光标记物会发出荧光。光学系统包括透镜、滤光片和反射镜，它们负责收集这些散射光或荧光信号，并将其导向至相应的检测器。通过调整光学元件的位置和角度，可以精确控制信号的方向和强度，从而提高数据的质量和分辨率。

3. 信号收集与光电转换系统

一旦光信号被光学系统捕捉，接下来的任务是由光电倍增管（PMTs）、雪崩光电二极管（APDs）或其他类型的光电探测器接收并将之转换为电信号。这些电信号随后被放大和数字化，以便计算机进行分析。不同的信号代表不同属性的测量结果，如细胞大小、形状或表面/内部标记物的存在。

4. 分选系统

对于具备分选功能的流式细胞仪，在检测过程后，可以根据特定参数（例如荧光强度）自动选择并分离出目标细胞。这是通过施加电荷给选定的液滴实现的，当带有电荷的液滴经过静电偏转板时，就会依据其携带的电荷方向和大小被引导至不同的容器中，实现细胞的精确分选。

实验步骤：

1. 细胞悬液的制备与标记

实验开始的第一步，是从组织切片或培养皿中提取细胞，并将其分散成均匀的单细胞悬浮液。此过程往往涉及到酶消化、机械剪切或温和振荡等多种方法，确保细胞不会聚集，保持良好的流动性。

荧光标记：为了使流式细胞仪能够识别和分析不同类型的细胞或细胞组分，必须使用特异性荧光染料或抗体对细胞进行标记。这一步骤至关重要，因为它直接影响了后续分析的准确性。荧光标记物的选择要基于目标抗原的特异性、细胞类型、以及预期的荧光信号强度。

2. 液流聚焦与激光扫描

液流的生成与稳定化：细胞悬液通过一个精细调节的压力系统，被引导至流式细胞仪的核心部位—微小的喷嘴口。在喷嘴处，由于压力的作用，细胞悬液被拉伸成一条细长的液柱，形成 “液流鞘层”结构。这一过程中，外部的缓冲溶液被施加压力，包围住中央的细胞悬液，使其在中心轴线上形成直线运动，有效防止细胞间的碰撞和聚团。

激光激发与信号捕获：当液流中的细胞依次穿过位于喷嘴下方的激光照射点时，会遇到一束高度集中且频率固定的激光束。激光能量足以激发细胞内携带的荧光标记物质，使之释放出独特的荧光信号。与此同时，细胞自身还会产生两种不同角度的散射光信号，分别反映细胞的物理尺寸和内部结构的复杂程度。这些信号被周围的光电倍增管（PMTs）或雪崩光电二极管（APDs）等敏感传感器捕捉。

3. 数据采集与分析

一旦光电传感器接收到散射光和荧光信号，便迅速将这些模拟信号转化为数字信息，供计算机处理。这个过程涉及对信号强度的量化、噪声滤除和基线校准，确保每条信号曲线的清晰度和准确性。

转化后的数据文件被导入专用的流式细胞仪软件，进行详细的统计分析。软件不仅能够计算细胞的数量、比例、平均荧光强度等基本参数，还具备高级的门控分析、双变量散点图绘制等功能，帮助科研人员从海量数据中挖掘出有价值的信息。通过设定不同的门限值，软件能够自动筛选出符合特定标准的细胞群落，实现细胞亚群的精细化鉴别。