前几期和科研宝子们分享了co-IP、GST-Pull down、SPR以及BLI实验，这一期小编带大家了解另一种常见的互作实验——酵母双杂。酵母双杂交系统是一种强大的遗传学工具，用于检测蛋白质之间的相互作用。凭借其在生理条件下检测蛋白质直接相互作用的能力、低假阳性率以及高成本效益比，成为了探索蛋白质网络、加速药物发现与功能基因组学研究不可或缺的强大工具。
原理
酵母双杂基于真核转录因子的结构特性——转录激活域（activation domain, AD）和DNA结合域（binding domain, BD）。在正常的转录因子中，AD和BD位于同一蛋白上，共同作用启动下游基因的转录。而在酵母双杂交系统中，这两种功能区被人为分离并分别连接到两个不同的测试蛋白上，如果这两蛋白能够形成复合体，就可以重新恢复转录因子的功能，从而激活报告基因的表达，指示X和Y蛋白质之间的相互作用发生。
实验步骤
1. 构建诱饵和猎物质粒：选取已知或假设作为互作一方的蛋白质（X），将其编码序列插入含有BD(Binding Domain)融合标签的酵母表达载体中，使X蛋白与Gal4 BD融合。选取另一方蛋白质（Y）或一组候选蛋白，分别将其编码序列插入带有AD(Activation Domain)融合标签的酵母表达载体中，使Y蛋白与Gal4 AD融合。形成BD-X和AD-Y两个重组质粒。
2. 酵母菌株转化：使用适当的酵母菌株，通常是缺乏内源Gal4转录因子的特殊品系。利用电穿孔法或锂盐介导法将上述两种质粒分别或同时导入酵母细胞。
3. 筛选阳性克隆：将转化后的酵母细胞接种于SD/-Leu-Trp培养基上，这是选择性平板，只允许成功摄取两个质粒的酵母生长。当蛋白质X和Y能够相互作用时，形成的复合体会使报告基因得以表达。在适宜条件下培养数天，直到出现明显的单个菌落。
4. 交互验证与报告基因检测：将阳性菌落接种于包含His3和LacZ报告基因的SD/-Leu-Trw-His/X-gal/IPTG培养基上，这一步骤用于进一步筛选真正发生的蛋白质互作。如果存在蛋白质互作，BD与AD会接近并重新构成完整的转录激活子，启动下游报告基因His3和LacZ的表达，使菌落在不含组氨酸的培养基上生长，同时显示蓝色(X-gal被β-半乳糖苷酶分解)。
5. 数据分析与验证：对于显示互作阳性的菌落，需通过测序确认所含猎物质粒的插入序列无误。可选用其他蛋白质互作鉴定技术如Co-IP(co-immunoprecipitation)进行互补验证，增强结论的可信度。
技术优势
1. 体内检测互作：Y2H能够在活细胞内模拟蛋白质间的真实互作，相比于体外实验更接近于生物体内的实际环境，从而提供了更为准确的生物学相关性。
2. 高通量筛选：通过构建文库，Y2H技术能够实现大规模的蛋白质互作筛选，快速发现未知的互作伙伴，加速蛋白质互作网络的绘制。
3. 操作简便快捷：相较于其他蛋白质互作技术，Y2H实验流程较为标准化，一旦建立了有效的酵母菌株和载体系统，即可快速展开实验，节省大量时间和成本。
4. 成本效益高：相对于其他高级别的蛋白质互作分析技术，Y2H所需材料和设备相对经济实惠，更适合资源有限的实验室开展初步研究工作。
技术局限性
1. 假阳性：Y2H系统可能会产生假阳性结果，可能是由于非特异性蛋白质聚集、自发激活的转录因子或载体本身的背景活性等原因造成。
2. 假阴性：即使两蛋白质确实互作，但在Y2H系统中也可能因为多种原因未能检测到，比如互作界面被遮挡、空间位阻限制了BD与AD的有效接触、或互作需要特定的后翻译修饰等因素。
3. 人工合成效应: 构建的融合蛋白可能会改变原有蛋白的功能性质。
尽管存在局限性，酵母双杂交仍然是研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要工具之一，尤其在早期的蛋白质互作网络构建中发挥了关键作用。随着技术的发展，诸如哺乳动物细胞双杂交、细菌双杂交等类似策略也被开发出来，以克服某些特定的限制，拓宽了蛋白质相互作用研究的方法学范围。
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