蛋白互作常见应用之——GST Pull-Down

上一期和科研宝子们分享了co-IP实验，这一期小编带大家了解另一种常见的互作实验——GST pull-down。Pull-Down主要用于体外验证已知蛋白间的直接相互作用，通过重组加GST标签的蛋白与靶蛋白的结合，非生理状态下的测试可能影响蛋白结构。其优点在于实验流程简单，利用高效商业化载体和GSH琼脂糖珠，难度较低。相比之下，Co-IP反映的是体内或细胞水平上的真实蛋白互作，保持了活细胞环境下蛋白间的自然互动，但无法明确区分直接或间接作用。实验复杂度高，需要高质量抗体和非变性条件，整体操作较为困难。两者互补，GST Pull-Down初筛直接互作，Co-IP确认体内情境，共同描绘蛋白互作全貌。

原理：

Glutathione S-transferase (GST) 是一种来自大肠杆菌的可溶性标签蛋白，具有多个优点，包括易于表达、稳定性和低毒性。在GST-Pull Down技术中，感兴趣的蛋白质（称为诱饵蛋白）被融合到GST标签上并在表达系统中表达，使得复合蛋白能够通过GST与谷胱甘肽琼脂糖珠的特异性结合而被固定。接下来，将细胞裂解物或蛋白质混合物与这些珠子孵育，其中含有的任何与诱饵蛋白相互作用的蛋白质（称为猎物蛋白）都将被一起捕获。最终，经过洗涤去除未结合的蛋白质后，通过SDS-PAGE和Western Blotting等方法对吸附的猎物蛋白进行鉴定和分析。

实验步骤：

（1）构建表达载体：将目标蛋白编码序列克隆到含有GST标签的表达载体（如pGEX系列质粒）中。

（2）大肠杆菌转化与蛋白表达：将构建好的表达载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，使用IPTG诱导GST-fusion蛋白的表达。

（3）蛋白纯化：通过亲和层析法（利用谷胱甘肽琼脂糖柱）纯化出GST-fusion蛋白，确保蛋白的高纯度。

如果你的目的是检测与重组GST-fusion蛋白相互作用的内源蛋白，那么你需要准备细胞裂解液或组织提取物。裂解液应使用适当的裂解缓冲液（如RIPA buffer），并添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。

（4）偶联GST-fusion蛋白：将纯化的GST-fusion蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠按照说明书推荐的比例进行混合，轻轻旋转孵育一段时间，让GST-fusion蛋白牢固地结合到珠子上。

（5）预清洗珠子：用适量的PBS或裂解缓冲液清洗偶联后的珠子，移除游离的GST-fusion蛋白和杂质。

（6）样本结合：加入准备好的细胞裂解液或蛋白溶液，使潜在的相互作用蛋白有机会与GST-fusion蛋白结合。这一过程通常需要在4°C下缓慢摇动过夜，以便充分反应。

（7）洗涤：清洗珠子多次，每次更换新鲜的PBS或裂解缓冲液，彻底去除未结合的蛋白和非特异性吸附物。这是非常关键的一步，直接影响实验的特异性和灵敏度。

（8）洗脱：使用还原型谷胱甘肽（GSH）缓冲液洗脱结合在珠子上的GST-fusion蛋白和相关相互作用蛋白。这一步骤需要精确控制，避免破坏蛋白结构。

（9）检测：将洗脱得到的样品进行SDS-PAGE电泳，随后可通过Western Blotting或质谱分析等方式检测和鉴定与GST-fusion蛋白相互作用的蛋白质。

（10）数据分析与解读：分析SDS-PAGE和Western Blot的结果，确认是否有与GST-fusion蛋白相互作用的条带出现。如果有，进一步通过质谱分析等手段鉴定具体的蛋白质身份。

应用场景：

GST-Pull Down技术在蛋白质组学研究、信号转导机制解析、药物靶标发现以及疾病机理探究中都有着广泛的应用。例如：

- 在蛋白质组学研究中，它可以用来筛选未知的蛋白质-蛋白质相互作用网络，为了解复杂生理过程提供线索。

- 对于药物研发，通过识别药物分子作用的直接靶标蛋白，有助于阐明药效机制，指导新药的设计和优化。

- 在病理学研究中，GST-Pull Down可以帮助揭示疾病状态下异常蛋白质交互网络的变化，为疾病的早期诊断和精准治疗提供理论依据。

GST pull-down常见问题解答

（1）蛋白表达在包涵体中？

包涵体是由于蛋白未正确折叠而聚集形成的。可以使用高浓度的尿素和盐酸胍使其变性解聚，变性后的蛋白可能需要通过逐步去除变性剂并加入适当的缓冲液来重新折叠，以恢复其功能性构象，然后尝试进行后续的GST pull-down实验。

（2）结果含有大量背景信号？

背景信号可能来自于非特异性结合。可以尝试增加洗脱步骤次数、使用更严格的洗脱条件，或添加非特异性结合抑制剂如BSA。

（3）蛋白条带模糊不清？

这可能是由于洗脱条件不足或蛋白纯度不高。可以增加洗脱液中洗脱剂的浓度，提高纯度，或使用其他柱层析方法提纯蛋白。

（4）出现假阳性结果？

假阳性结果主要是由于自发形成的聚集态，非特异的吸附和其他非特异性相互作用引起的。为了减少GST pull-down中的假阳性结果，通过添加更多的非离子型洗涤剂和用特定的pH缓冲液来消除这些非特异性的互作，同时在检测前应该用0.1％的Tween-20（或其他洗涤剂）处理GST-beads。

（5）选择适合的阴性对照组？

选用不含目的蛋白的空GST蛋白作为阴性对照，以评估GST beads的特异性并排除假阳性结果。如果GST-only也能拉下大量的蛋白质，说明实验条件需要调整。

（6）co-IP能验证到互作，为什么GST pull-down却验证不到？

Co-IP是体内实验，可能检测到基于其他蛋白作为桥梁的间接互作，而GST pull-down证明的是体外两个蛋白的直接相互作用，如果中间桥梁缺失，则不会呈现互作状态。

（7）弱相互作用无法捕捉？

增加孵育时间和降低洗涤强度，给弱相互作用留出更多机会被捕捉；尽量模拟体内条件，如使用特定的缓冲液，帮助维护脆弱的相互作用界面；利用化学交联剂预先稳定复合物，再进行GST-Pull Down，可以提高敏感的蛋白质相互作用检出率。

下一期小编将为科研宝子们带来另一种常见的蛋白互作实验——SPR，敬请期待吧！