蛋白互作常见应用之——免疫共沉淀 Co-IP

深入理解蛋白质相互作用对于揭示生物体内的分子机制至关重要。今天小编带大家了解最常见的蛋白质相互作用实验技术之一——免疫共沉淀。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）主要用于检测和研究蛋白质-蛋白质相互作用。它基于抗体对特定抗原的特异性识别，能够从复杂的细胞或组织提取物中富集目标蛋白及其结合伙伴，进而分析蛋白质复合体的组成。这种方法的独特之处在于能够在接近生理条件的状态下，捕捉和证实蛋白质之间的交互作用，因此被视为探究蛋白质复合体构成及动态变化的重要工具。相比于其他的分子间相互作用鉴定技术，如GST pull-down等，免疫共沉淀可以在生理条件下检测，具有高特异性和灵活性。

免疫共沉淀利用抗体与抗原之间的高特异性结合。在实验中，抗体（通常为多克隆或单克隆抗体）与目标蛋白（抗原）结合形成免疫复合物。通过加入蛋白质A或G磁珠，这些免疫复合物可以被沉淀下来，随后通过洗涤去除未结合的蛋白，最后通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western Blotting（蛋白质印迹）等技术来鉴定和分析共沉淀的蛋白质。

 

实验步骤：

1. 样本制备

细胞培养：根据研究目的，选择合适的人或动物细胞系进行培养，待达到适宜的密度后可进一步处理。

裂解细胞：用适量的裂解缓冲液（含有蛋白质酶抑制剂和去垢剂如NP-40）处理细胞，破坏细胞膜和细胞器结构，释放胞内蛋白质。

离心澄清：将裂解物进行离心，去除细胞碎片和其他大颗粒杂质，获得上清液作为后续免疫沉淀的原料。

2. 免疫沉淀

抗体预处理：预先将抗原特异性的第一抗体（针对感兴趣的靶标蛋白质）与蛋白A/G珠或其他亲和介质混合，形成抗体-介质复合物。

样本结合：将上述复合物与之前制备的细胞裂解液温和混匀，置于旋转器中过夜或至少数小时，允许抗体与样品中的靶蛋白充分结合。

3. 清洗和洗脱

离心收集含有免疫复合物的珠子，弃掉上清，随后多次用低盐或高盐洗脱缓冲液清洗珠子，去除未结合的蛋白质和其他杂质。

洗脱：采用含还原剂的洗脱缓冲液或SDS-PAGE样品缓冲液处理珠子上的免疫复合物，使其脱离介质并溶解。

4. 电泳验证

将洗脱产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离不同大小的蛋白质成分。将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜或其他固相支持物上。使用第二抗体（通常是HRP或荧光标记的，能识别第一步中的第一抗体）进行Western blotting，以检测与靶蛋白共同沉淀下来的其他蛋白质伙伴。

 

免疫共沉淀技术广泛应用于以下领域：

1. 鉴定已知两个蛋白是否体内互作：可以用来验证两个蛋白质之间是否直接相互作用，或确定一个蛋白质在细胞内的相互作用网络。

2. 研究蛋白质复合体的组成：通过Co-IP，可以分析特定蛋白质复合体中所有成员，有助于理解细胞内信号传导、转录调控等复杂生物过程。

3. 药物靶点研究：通过检测目标蛋白与药物分子或潜在药物靶点之间的相互作用，可以评估药物的结合特性和药效机制。

4. 疾病机制探索：在疾病研究中，Co-IP可以帮助揭示异常蛋白质相互作用，为疾病的发生机制和治疗策略提供线索。

 

常见实验失败原因和解决方法：

1. 高背景

可能原因:洗涤不完全。

对应解决:增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度，多次充分洗涤。

可能原因:非特异性蛋白吸附于磁珠上。

对应解决:预处理磁珠防止非特异性吸附。

可能原因:抗体本身特异性不好。

对应解决:选择合适的抗体，可以考虑单抗。

可能原因:抗体用量太多。

对应解决:梯度优化减少抗体。

可能原因:使用了过多的细胞或组织用于裂解。

对应解决:推荐使用100-500μg细胞裂解物。

可能原因:抗原降解。

对应解决:保证样品中加入了蛋白酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品。

2. 没有信号

可能原因:目的蛋白在样本中表达量低或者不表达。

对应解决:首先对目的蛋白表达量进行检测，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并进行预处理

可能原因:细胞裂解液使用不当

对应解决:根据实验需要选择，慎重考虑。

可能原因: 目的蛋白未被洗脱。

对应解决:保证使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和PH值合适

可能原因:抗原降解。

对应解决:保证样品中加入了蛋白酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品。

可能原因:抗体没有很好的与微珠相互结合

对应解决:选择合适的微珠。

可能原因:抗体选择不当或者不工作。

对应解决:利用WB对抗体进行验证。

3. 假阳性

 

以上图的结合模式，可能出现的“假阳性”及对应需要设置的实验对照有：

1. 磁珠与蛋白X非特异性结合

对照：磁珠+抗体X+抗体Y

2. 磁珠与蛋白Y非特异性结合

对照：磁珠+蛋白Y

3. 抗X抗体和Y非特异性结合

对照：磁珠+抗体X+蛋白Y

4. 抗X抗体(或磁珠)会和细胞裂解液内其它蛋白结合

对照：磁珠+抗体X+未转染质粒的宿主细胞裂解液

5. 抗体的非特异性结合

对照：normal lgG+蛋白X+蛋白Y

4. 蛋白质复合体不稳定

问题表现：虽然能检测到相互作用蛋白，但在后续处理过程中容易解离。

解决方案：使用低盐浓度的洗涤缓冲液；缩短温育和洗涤时间，减少机械应力；尽可能在低温条件下操作。

5. 抗体交叉反应

问题表现：出现多个额外的条带，表明抗体可能识别了多个非目标蛋白。

解决方案：更换抗体，优选那些具有更高特异性并通过多重验证的产品；或者使用抗体吸附的方法去除对其他蛋白质的交叉反应性。

问题表现：即使使用了阴性对照，仍观察到大量条带或信号，这可能是由于非特异性蛋白与抗体或固相载体（如蛋白A/G珠）的结合所致。

解决方案：增加洗涤次数和强度；选择更高特异性的抗体；预先用未标记的抗体或蛋白A/G珠饱和样品，减少非特异性结合位点。

 

小编总结了几点小Tips帮助大家提高co-IP实验成功率和质量：

1. 抗体的选择至关重要：使用高质量、高特异性的抗体对于成功的免疫共沉淀至关重要。优先选用经过Co-IP验证过的抗体。

2. 温和的裂解条件：确保温和的裂解条件，保留蛋白质-蛋白质的相互作用。通常使用NP-40或Triton-X-100，控制裂解时间和温度。

3. 避免高浓度变性剂：不要使用高浓度变性剂如 0.2%SDS，以免破坏蛋白质相互作用。裂解液中应添加各种酶抑制剂，以保护蛋白质免受降解。

4. 预先将抗体与磁珠或蛋白A/G珠在4°C下孵育过夜，增强抗体与珠子的结合力。使用前彻底清洗珠子，移除任何可能引起背景信号的非特异性蛋白。

5. 上样时要迅速，避免样品扩散，导致相邻加样孔的交叉污染

6. 某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，可以用1.0% BSA代替。

7. 如果要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白

 

下一期，小编将带大家继续了解GST pull down实验内容，敬请期待吧！