T细胞解决方案 T cell Panel

T细胞（T lymphocyte）来源于骨髓的造血干细胞，在胸腺中分化成熟后，通过血液和淋巴系统分布到全身免疫器官，发挥适应性免疫功能。T细胞的发育过程分为三个主要阶段：双阴性T细胞（DN）、双阳性T细胞（DP）和单阳性T细胞（SP）。在胸腺内，T细胞经历阳性选择和阴性选择：阳性选择使T细胞识别自身MHC，确保其能正常功能；阴性选择通过淘汰对自身抗原有高亲和力的T细胞，确保自身免疫耐受。T细胞根据功能特性可以主要分为：辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞，CD4 T细胞在外周被激活为辅助性T细胞（Th），而CD8 T细胞则被激活为细胞毒性T细胞（CTL）。

Fig 1. Maturation and selection of T cells（10.1016/bs.ircmb.2018.07.004）

淋巴细胞分型
T细胞类型	标志物
T 淋巴细胞	CD3+
Th 淋巴细胞	CD4+
Tc 淋巴细胞	CD8+
双阳 T 细胞	CD4+CD8+
活化 T 细胞	CD3+CD25+
活化 Th 细胞	CD4+CD25+
活化 Tc 细胞	CD8+CD25+
初始 Th 细胞	CD4+CD45RA+CCR7+
中央记忆型 Th 细胞	CD4+CD45RO+CCR7+
效应记忆型 Th 细胞	CD4+CD45RO+CCR7-
效应 Th 细胞	CD4+CD45RA+CCR7-
初始 Tc 细胞	CD8+CD45RA+CCR7+
中央记忆型 Tc 细胞	CD8+CD45RO+CCR7+
效应记忆型 Tc 细胞	CD8+CD45RO+CCR7-
效应 Tc 细胞	CD8+CD45RA+CCR7-

CD4+ T细胞

CD4+ T细胞由初始CD4+ T细胞（Naive CD4）在不同细胞因子的影响下分化为多个功能性亚群。每个亚群都有其特征性的细胞因子谱，并且通过特定的转录因子进行调控，不同的信号通路也参与了这些细胞因子的表达调控。例如，Treg细胞的主要作用靶细胞是其他T细胞，包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；而Th1细胞则主要靶向巨噬细胞和细胞毒性T细胞，促进这些细胞的活化和功能执行。

Fig 2. CD4+ cell differentiation and effector function（ 10.1038/s41423-018-0004-4）

CD4+ T细胞亚群的表型、功能和标志物
特性	Th1	Th2	Th9	Th17	Tfh	Treg
主要功能	清除病毒和细菌感染的宿主细胞	协助B细胞和嗜酸性粒细胞，抵御寄生虫并参与过敏反应	防御寄生物和促进抗肿瘤免疫反应	增强中性粒细胞的募集，排除真菌和细菌感染	辅助B细胞在生发中心中产生抗体	免疫抑制，控制自身免疫性疾病，调节体液生成
靶细胞标志物	CD8	CD4, CXCR3	CD4, CCR4	CD4, CCR6	CD4, CXCR5	CD4, CD25
分化细胞因子	IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18, IL-27	IL-4, IL-5, IL-13, IL-33	TGF-β	TGF-β, IL-6, IL-1, IL-21, IL-23	IL-6, IL-21, IL-27	TGF-β, IL-10
效应细胞因子	IFN-γ, TNF, LT-α	IL-4, IL-5, IL-13	IL-9, IL-10	IL-17, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, TNF, CCL20	IL-4, IL-10, IL-21	TGF-β, IL-10
转录因子	T-bet, Stat1, Stat4	GATA3, Stat5, Stat6	GATA3, Smad3, Stat6	RORγt, Stat3, RORα	Bcl-6, MAF	FoxP3, Smad3, Stat5

CD8+ T细胞

细胞毒性T淋巴细胞（CTL），即CD8+ T细胞，是适应性免疫系统的重要组成部分，能够抵御病毒、细菌和肿瘤。其杀伤功能主要通过三种机制实现：1) 穿孔素和颗粒酶B介导的直接杀伤，CTL释放穿孔素在靶细胞膜上打孔，颗粒酶B进入细胞，引发凋亡；2) Fas/Fas-L途径介导的死亡受体杀伤，CTL通过Fas-L与靶细胞的Fas结合，激活凋亡途径；3) 间接杀伤，CTL通过分泌细胞因子（如TNF-α）诱导邻近细胞死亡。Naive CD8+ T细胞可分化为多种效应亚群，如Tc1、Tc2、Tc9、Tc17和CD8+调节性T细胞，每个亚群在不同环境下表达特异性转录因子，并生成特征性的细胞因子和效应分子。

Fig 3. Development and activation of CD8+ T cells.（10.3389/fimmu.2023.1149622）

小鼠CD8+T细胞不同亚群的细胞标志物
亚群	表面标志物	细胞内/转录因子	细胞因子
Naive	CD62L, CD127, CCR7, CXCR3
效应性	CD25, CD30, CD44, CD69, CD122, OX40, LAG-3, ICOS, KLRG1⁺⁺	T-bet, BLIMP1, Id2	IFNγ, IL-2, 穿孔素, 颗粒酶B, TNFα, MIP-1a, MIP-1b, RANTES
效应性记忆	CD44, KLRG1⁺⁺, CD57	Eomes, T-bet, BLIMP1	颗粒酶B, IFNγ, IL-2, 穿孔素, TNFα
中枢记忆	CD44, CD62L⁺⁺, CD127, CCR7⁺⁺	Bcl6, Eomes, T-bet	IFNγ, IL-4
调节性	CD25, CD122, GITRL, CD44, CD62L^High	Foxp3	TGFβ, IL-10

人CD8+T细胞不同亚群的细胞标志物
亚群	表面标志物	细胞内/转录因子	细胞因子
Naive	CD27, CD45RA, CD62L, CD127, CCR7
效应	CD25⁺⁺, CD69⁺⁺, KLRG1⁺⁺, CD30, OX40, ICOS, TIM3	T-bet	IFNγ, IL-2, 穿孔素, 颗粒酶B, TNFα, MIP-1a, MIP-1b, RANTES
效应性记忆	CD44, CD45RO, CD62L_Low, CD127⁺⁺, CCR7_Low, KLRG1⁺⁺	Eomes, T-bet	颗粒酶B, IFNγ⁺⁺, IL-2, 穿孔素, TNFα⁺⁺
中枢记忆	CD45RO, CD62L_Low, CD127⁺⁺, CCR7^Low, CD27, CD28	Eomes, T-bet	IFNγ, IL-2, TNFα
失能/调节性	CD57, CD28^-, KLRG1⁺⁺, Lag-3, PD-1, HLA-DR	Foxp3, Ikaros, Egr1或Egr2	IL-2_Low

T细胞流式检测操作步骤

■样品准备
收集样本：从血液、骨髓或淋巴组织中提取单细胞悬液。常见样本来源包括外周血、脾脏、淋巴结等。
血液样品：使用EDTA管收集外周血，进行红细胞裂解（红细胞裂解液应使用蒸馏水或去离子水稀释至工作浓度）。
骨髓样品：直接收集骨髓细胞悬液。
淋巴器官样品：通过机械或酶消化脾脏、淋巴结，获得单细胞悬液。
细胞计数：使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数，确保细胞浓度适合抗体标记，通常为1-2 × 10^6 cells/mL。

■抗体标记
选择抗体：根据实验设计选择针对T细胞的表面或胞内标志物的荧光标记抗体。常用的T细胞标志物包括：
CD3、CD4、CD8：T细胞的核心表面标志物。
CD25：活化T细胞的标志物。
Foxp3：调节性T细胞（Treg）的标志物。

■抗体孵育：
将荧光标记的抗体加入100 µL的细胞悬液中（通常抗体量为1-5 µL/百万细胞）。
在冰上或4°C避光孵育20-30分钟，避免光照以防荧光抗体降解。
细胞洗涤：
用流式缓冲液（PBS或PBS + 2% FBS）洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
每次洗涤后以300-400g离心5分钟，小心弃去上清液。

■细胞染色（可选）
死细胞排除染色（推荐）：使用死细胞染料（如7-AAD、PI或DAPI）在抗体标记完成后进行染色，确保只分析活细胞。死细胞的存在会导致假阳性结果，因此需要通过染料进行排除。
细胞内染色（可选）：如果需要检测胞内因子或蛋白质，需对细胞进行固定和通透处理。
使用4%多聚甲醛固定细胞10-15分钟。
使用通透液（如0.1% Triton X-100或专用试剂盒）处理细胞，使抗体进入胞内，随后按照上述表面标志物染色步骤进行抗体孵育和清洗。

■数据采集
仪器设定：根据所用的荧光抗体选择适当的激光器和通道。常用染料和通道包括：
FITC、PE、APC、PerCP等，确保染料与流式细胞仪激光配置相匹配。
样品上机：将处理后的样品装入流式细胞仪的采样管，准备进行数据采集。
采集细胞数：通常建议采集10,000至50,000个细胞，以确保统计学的有效性。
设定门控：
根据FSC（前向散射）和SSC（侧向散射）图，识别淋巴细胞群体并排除碎片。
根据T细胞特异性表面标志物（如CD3、CD4、CD8），设定适当的门限，识别T细胞及其亚群。

■ 数据分析
流式数据分析：通过流式细胞分析软件（如FlowJo、FCS Express等）分析采集到的数据。
生成散点图、直方图，定量分析各T细胞亚群的比例及荧光强度。
设置门控策略：从总淋巴细胞中筛选出T细胞（如CD3+），然后基于其他表面标志物（如CD4、CD8）进一步分析T细胞亚群（如辅助性T细胞和细胞毒性T细胞）。
荧光补偿：使用适当的荧光补偿，减少荧光通道之间的信号重叠，确保数据的准确性。

■结果报告
结果解释：结合流式细胞数据，分析T细胞的数量、比例及各亚群的状态，判断活化或调节性T细胞的存在与分布。
数据展示：将分析结果以表格或图表形式展示，便于进一步的研究或结果汇报。

■注意事项：
抗体孵育时避光操作：荧光抗体在光线下容易退化，需全程避光操作。
设置适当的对照：实验应包含阴性对照、单染色对照、同型对照等，确保信号的特异性和准确性。
死细胞排除：使用死细胞染料确保只分析活细胞，避免死细胞产生假阳性信号。
样本浓度和细胞状态：保持适当的细胞浓度，确保细胞悬浮均匀，避免细胞团块的形成和数据偏差。

流式产品推荐:

人 CD4+ T Cell 相关流式抗体
Target	Clone number	CAT.	Species
CD194(CCR4)	SAA0069	FHE85312	Human
CD185(CXCR5)	16D7	FHD99912	Human
CD127	MD-707	FHD19412	Human
CD196(CCR6)	R612	FHE85512	Human
CD25	1H4	FHB95812	Human
CD294(CRTH2)	SAA0325	FHJ94213	Human
CD183(CXCR3)	1C6	FHE67932	Human
CD3	SP34	FHC27752	Human
CD4	OKT4	FHB95932	Human

小鼠 CD4+ T Cell 相关流式抗体
Target	Clone number	CAT.	Species
CD3E	145-2C11	FMC27711	Mouse
CD4	5A8	FHB95921	Mouse
CD45	SAA0570	FMC34013	Mouse
CD8	G10-1	FHK18511	Mouse

参考文献：

[1]Spetz, Johan et al. “T Cells and Regulated Cell Death: Kill or Be Killed.” International review of cell and molecular biology vol. 342 (2019): 27-71. doi:10.1016/bs.ircmb.2018.07.004

[2]Knochelmann, Hannah M et al. “When worlds collide: Th17 and Treg cells in cancer and autoimmunity.” Cellular & molecular immunology vol. 15,5 (2018): 458-469. doi:10.1038/s41423-018-0004-4

[3]Ding, Jia-Tong et al. “Landscapes and mechanisms of CD8+ T cell exhaustion in gastrointestinal cancer.” Frontiers in immunology vol. 14 1149622. 25 Apr. 2023, doi:10.3389/fimmu.2023.1149622