自然杀伤性细胞解决方案 NK cell Panel

自然杀伤细胞（NK细胞）是继T细胞和B细胞之后的第三大类淋巴细胞，负责清除老化、受病毒感染以及肿瘤等异常细胞。作为免疫系统中的关键“战士”，NK细胞无需抗原的预先刺激或活化，即可直接识别并杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞，广泛参与抗肿瘤、抗感染和免疫调节，因而被视为固有免疫中最重要的组成部分之一，同时也是人体抵御癌症的第一道防线。根据目前的主流模型，NK细胞起源于骨髓中的CD34+CD45RA+造血祖细胞（HPCs），经由常见淋巴祖细胞（CLPs）和NK细胞前体（NKPs）逐步分化，最终成熟为外周血中的常规NK细胞（cNK）或定居于组织的组织驻留NK细胞（trNK）。

Fig 1.Mechanisms leading to impaired cytotoxicity in NK cells within the tumor microenvironment(doi.org/10.1016/j.lfs.2023.121997)

Fig 2.Surface markers defining immature and mature NK Cells in mouse and human

Human NK细胞分化发育,根据CD56的表达密度，NK细胞可分为两大亚群：CD56dim和CD56bright。CD56dim NK细胞主要存在于外周血，高表达CD16、KIR和LFA-1，低表达CD94/NKG2A，仅有中等亲和力的IL-2受体（IL-2Rβ），以细胞毒活性为主，产生细胞因子的能力较低。相反，CD56bright NK细胞主要分布在次级淋巴组织，高表达高亲和力的IL-2受体（IL-2Rαβ），以及CD94/NKG2A和CD62L，低表达CD16和KIR，主要通过分泌细胞因子如IFN-γ、TNF-β、IL-10、IL-13和GM-CSF来发挥免疫调节功能，但其细胞毒活性较低。

小鼠与人类的NK细胞在分化发育和功能上有许多相似之处，但也存在显著的差异。小鼠未成熟NK细胞（iNK）通常标记为CD11b- CD27+，而人类的未成熟NK细胞则以CD56bright CD16-为特征。成熟NK细胞在小鼠中标记为CD11b+ CD27-，在人类中则表现为CD56dim CD16+。人类的CD56dim NK细胞占大多数，主要在外周血中发挥细胞毒作用，而CD56bright NK细胞则集中在次级淋巴组织，主要通过分泌细胞因子进行免疫调节。相比之下，小鼠的成熟NK细胞也具有强大的细胞毒活性，未成熟NK细胞则更侧重于细胞因子的分泌。受体方面，小鼠NK细胞表达NK1.1和Ly49家族受体，这些受体在识别MHC I类分子时与人类的KIR受体功能类似，但具体机制不同。此外，小鼠和人类在NK细胞的组织分布上也存在差异，小鼠的未成熟NK细胞更多存在于骨髓和脾脏，而人类的CD56bright NK细胞主要分布于淋巴结等次级淋巴组织。

NK细胞流式检测操作步骤：

■样本准备
样本来源：从外周血、骨髓或组织中获取单个细胞悬液。外周血是常见的样本来源，通常需要通过密度梯度离心法（如Ficoll）分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
细胞计数：使用血细胞计数器或自动细胞计数器计算细胞数量，并调节细胞浓度，一般调整至每100 µL 1-2 × 10⁶ 个细胞。

■表面抗原染色
抗体选择：选择针对NK细胞特异性标志物的荧光抗体，常用的NK细胞表面标志物包括：
CD56: NK细胞的主要标志物之一（在人类中）。
CD16: 识别FcγRIII，常与CD56联合使用以区分不同亚型的NK细胞（如CD56^dimCD16^+和CD56^brightCD16^-）。
CD3: 用于区分NK细胞（CD3^-）与T细胞（CD3^+）。
NKG2A、NKG2D: 激活或抑制性受体的标志物。
其他标志物：如NKp30、NKp46、TIGIT、CD314 (NKG2D)等。
抗体孵育：将适量荧光标记抗体加入细胞悬液中，通常按照供应商建议的浓度加入。轻轻混匀，避免气泡。将细胞在冰上或4°C环境中孵育30分钟至1小时，避光。

■洗涤
细胞洗涤：孵育后，用流式细胞仪洗涤缓冲液（如PBS或含有BSA/FBS的PBS）清洗细胞2-3次，以去除未结合的抗体。
离心：以300-400 g离心5分钟后弃去上清，保留细胞沉淀。

■固定与通透化（可选）
固定（可选步骤）：如果需要对胞内抗原进行检测，使用固定液（如4%多聚甲醛）将细胞固定。
通透化（仅在胞内染色时）：使用通透化试剂（如Triton X-100或Triton Saponin）使细胞膜通透，以允许胞内抗体进入细胞。

■死细胞排除（可选）
使用专门的染料（如7-AAD或DAPI）染色，以排除死细胞，从而确保数据分析时只检测活细胞。

■数据采集
流式细胞仪设置：根据抗体的荧光染料，设定流式细胞仪的激光器和滤光片。常见的荧光染料有FITC、PE、APC、PerCP等。
运行样本：将染色后的样本放入流式细胞仪进行数据采集。根据样本浓度和细胞数，通常采集数万至百万个细胞。

■数据分析
选择门控策略：
散点图（FSC/SSC）排除细胞碎片并选择淋巴细胞群体。
CD3阴性细胞门：用CD3染色，将T细胞（CD3+）与NK细胞（CD3-）区分开来。
CD56+/CD16+群体：在CD3-群体中，选择CD56和CD16的双阳性或双阴性群体进行NK细胞亚群的分析。
进一步的受体分析：可以根据实验需求分析NK细胞激活受体（如NKG2D）或抑制受体（如NKG2A）的表达水平。
结果解释：分析NK细胞亚群的比例、受体表达情况以及活化/抑制状态，结果通常以直方图或双参数图表展示。

■数据验证和报告
对所得数据进行重复实验验证，并通过分析软件（如FlowJo或FACSDiva）进行详细的数据分析，得出结论并生成报告。

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参考文献：

[1]From the American Association of Neurological Surgeons (AANS), American Society of Neuroradiology (ASNR), Cardiovascular and Interventional Radiology Society of Europe (CIRSE), Canadian Interventional Radiology Association (CIRA), Congress of Neurological Surgeons (CNS), European Society of Minimally Invasive Neurological Therapy (ESMINT), European Society of Neuroradiology (ESNR), European Stroke Organization (ESO), Society for Cardiovascular Angiography and Interventions (SCAI), Society of Interventional Radiology (SIR), Society of NeuroInterventional Surgery (SNIS), and World Stroke Organization (WSO) et al. “Multisociety Consensus Quality Improvement Revised Consensus Statement for Endovascular Therapy of Acute Ischemic Stroke.” International journal of stroke : official journal of the International Stroke Society vol. 13,6 (2018): 612-632. doi:10.1177/1747493018778713