树突状细胞(Dendritic cell,DC)是一类专职的抗原呈递细胞(APC),源自造血干细胞。近年来的研究表明,DC在摄取、加工和呈递抗原方面具有高度的效率。未成熟的DC细胞具备较强的迁移能力,而成熟的DC细胞则能够有效激活初始T细胞,从而适时启动机体的适应性免疫反应。
在天然免疫系统中,树突状细胞通过识别病原体起到关键作用,而在适应性免疫系统中,它们通过MHC分子将抗原肽呈递给Naïve T细胞,诱导其激活和分化,标志着适应性免疫的启动。此外,DC细胞还促进效应T细胞的分化并调节T细胞的耐受性。树突状细胞不仅参与抗原呈递,还通过分泌细胞因子和生长因子来增强和调控免疫反应。它们广泛分布于体内的局部组织,尤其是淋巴器官和表皮系统(如肠道和皮肤),在这些部位扮演着免疫哨兵的角色。
DC细胞主要分为经典型树突状细胞(cDC)和浆细胞样树突状细胞(pDC),大多数DC细胞来源于共同DC前体(CDP)。pDC在骨髓中进一步发育,而cDC则在外周组织中分化。此外,在病原体引发的炎症中,单核细胞可分化为单核样树突状细胞(moDCs)。
Fig 1.Dendritic cells and immunoregulation.
人树突状细胞包括多种亚型:单核来源的Mo-DC参与炎症反应,pDC主要通过分泌干扰素抗病毒,cDC1和cDC2负责激活T细胞,XCR1+ DC专门进行交叉抗原呈递,而朗格汉斯细胞(LC)则在表皮中负责免疫监视和抗原提呈。
人树突状细胞分类/来源 |
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细胞类型 |
来源 |
标志物 |
Mo-DC |
外周血/脐带血 |
HLA-DR+, CD14+, CD11b+, CD209 (DC-SIGN)High, CD83+ |
pDC |
外周血/脐带血 |
HLA-DR+, CD303 (BDCA-2)+, CD304 (BDCA-4)+, CD123 (IL-3Rα)High, ILT7+, CD11c- |
CD1c+ cDC |
外周血/脐带血 |
HLA-DR+, CD11c+, CD1c+, CD123 (IL-3Rα)+, CD11bLow |
CD141+ cDC |
外周血/脐带血 |
HLA-DR+, CD141 (BDCA-3)+, CLEC9A (DNGR-1)+, XCR1+, CD13+, CD172 (SIRPα)Low, CD11bLow |
XCR1+ cDC |
外周血/脐带血 |
HLA-DR+, CD141 (BDCA-3)+, CLEC9A (DNGR-1)+, XCR1+, CD13+, CD172 (SIRPα)Low, CD11bLow, CD83+, CD86+ |
LC |
骨髓 |
HLA-DR+, CD11c+, CD207+, CD205 (DEC205)+, CD1a+ |
小鼠的树突状细胞(DC)与人类相似,分为单核来源的Mo-DC、浆细胞样DC(pDC)、经典DC(cDC1和cDC2)以及皮肤中的朗格汉斯细胞(LC)。小鼠cDC1以CD8α和XCR1为标志,主要负责交叉呈递抗原,激活CD8+ T细胞,而cDC2则表达CD11b和CD4,参与激活CD4+ T细胞。虽然小鼠和人类的树突状细胞在功能和标志物上有相似性,但在具体的标志物表达和某些功能细节上存在差异,特别是在交叉呈递和抗病毒免疫反应中。
小鼠树突状细胞分类/来源 |
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细胞类型 |
来源 |
标志物 |
pDC |
骨髓、脾脏、肺 |
MHC class II+, PDCA-1 (BST2)+, SiglecH+, B220 (CD45R)+, CD11b-, CD11cLow, Ly6CHigh |
CD4+CD8+ cDC |
骨髓、脾脏、肺、肠道 |
MHC class II+, CD11c+, CD4+, CD8α+, CD172 (SIRP-α)+ |
CD8+ cDC |
骨髓、脾脏、肺、肠道 |
MHC class II+, CD11c+, CD8α+, XCR1+, CLEC9A (DNGR-1)+, CD205 (DEC205)+ |
LC |
骨髓、皮肤 |
CD11c+, MHC class II+, CD205 (DEC205)+, CD207 (Langerin)+, CD1a+, F4/80+, CX3CR1+ |
Mo-DC |
骨髓 |
CD11c+, MHC class II+, CD209 (DC-SIGN)+, CD11b+ |
CD11b+ cDC |
肺、肠道 |
MHC class II+, CD11b+, CD11c+, CD64+, Ly6CLow |
XCR1+ cDC |
肺、肠道 |
MHC class II+, CD11b+, CD11c+, XCR1+, CLEC9A (DNGR-1)+, CD205 (DEC205)+ |
■样品准备
组织样品处理:从组织(如脾脏、淋巴结、肺或皮肤等)或外周血中分离单细胞悬液。
细胞处理:
对于组织样品,可以使用机械研磨或酶消化(如胶原酶、DNase)制备单细胞悬液。
对于外周血样品,可以使用Ficoll梯度离心法分离单个核细胞(PBMC)。
细胞计数:使用自动细胞计数器或手动计数,调整细胞浓度至1–2 × 10^6 cells/mL。
■ 封闭非特异性结合
封闭Fc受体:加入Fc受体阻断剂(如Mouse Fc Block或Human Fc Receptor Blocking Reagent)或5-10%的正常血清(如牛血清、山羊血清等)封闭非特异性结合。
在冰上孵育10-15分钟,避免非特异性抗体结合。
■抗体孵育
选择抗体:根据实验需求选择针对树突状细胞表面标志物的荧光标记抗体。
常用的标志物包括:
pDC标志物:PDCA-1 (BST2)、SiglecH、B220、CD11c<sup>Low</sup>。
cDC1标志物:CD8α、XCR1、CLEC9A (DNGR-1)。cDC1标记:CD8α、XCR1、CLEC9A (DNGR-1)。
cDC2标志物:CD11b、CD4、SIRPα (CD172)。
LC标志物:CD207 (Langerin)、CD1a、CD205。
按照抗体说明书的建议用量,将抗体加入100 μL的细胞悬液中(通常为1–5 μL/百万细胞)。
孵育:在冰上或4°C避光孵育30分钟。
■细胞洗涤
用流式缓冲液(PBS + 2% FBS或BSA)洗涤细胞两次,每次离心300-400g,5分钟,弃去上清。
■细胞染色(可选)
死细胞排除染色:使用死细胞染料(如7-AAD、PI或DAPI)染色,确保只分析活细胞。
胞内染色(可选):如果需要检测胞内抗原或细胞因子(如TNF-α、IL-10等),在表面染色后进行固定和通透。使用4%多聚甲醛固定细胞10-15分钟,然后使用通透液(如0.1% Triton X-100)进行透化。
■数据采集
流式细胞仪设定:根据抗体的荧光标记选择适当的激光器和通道。常见荧光标记物如FITC、PE、APC、PerCP等。
样品上机:将处理后的细胞悬液装入流式细胞管,使用流式细胞仪进行数据采集。
采集细胞数:通常采集10,000–100,000个细胞,以确保结果的统计学可靠性。
■数据分析
使用流式细胞分析软件(如FlowJo、FCS Express、CytExpert)进行数据分析。
门控设置:首先通过FSC和SSC图区分树突状细胞和其他细胞群体,排除细胞碎片。然后根据特异性标志物(如CD11c、MHC II等)进行初步门控。
荧光补偿:设置适当的补偿,减少不同荧光染料通道之间的信号重叠。
对照组:设置阴性对照、同型对照和单染色对照,以确保结果的准确性。
■结果解释
分析树突状细胞亚群的分布和表型,例如cDC1、cDC2和pDC等。
根据实验需求分析树突状细胞在不同实验条件下的活化状态(如CD80、CD86等活化标志物的表达)。
■注意事项
抗体孵育时避免光照,避免荧光标记抗体的降解。
确保样本浓度适当,以免影响抗体标记和流式分析的准确性。
补偿设置要合理,避免荧光通道之间的干扰,确保数据准确。
Target |
Clone number |
CAT. |
Species |
---|---|---|---|
CD1a |
2113 |
FHC18710 |
Human |
CD11b |
M1/70 |
FMC86630 |
Mouse |
CD11C |
N418 |
FMD41110 |
Mouse |
CD80 (B7-1) |
IDEC-114 |
FHE03410 |
Human |
CD80 (B7-1) |
16-10A1 |
FME03410 |
Mouse |
CD83 |
60B10 |
FHF85910 |
Human |
CD86 |
GL1 |
FME33810 |
Mouse |
HLA-DRA |
1D09C3 |
FHM00810 |
Human |
CD11b |
M1/70 |
FMC86630 |
Mouse |