巨噬细胞解决方案 Macrophages cell Panel

巨噬细胞（Macrophages，Mφ）是先天免疫系统的重要细胞，具有吞噬病原体、清除死细胞及调节免疫反应的功能。1882年，Elia Metchnikoff首次发现巨噬细胞，因其强大的吞噬作用而得名。巨噬细胞主要来源于骨髓中的单核细胞，这些单核细胞进入血液后迁移至不同组织，分化为驻留巨噬细胞，如肝脏中的库普弗细胞、肺泡巨噬细胞和脑部的微胶质细胞。除了清除病原体，巨噬细胞还能通过分泌细胞因子和趋化因子调节免疫反应。根据功能状态，巨噬细胞可分为M1型（促炎型）和M2型（抗炎型）。M1型通过分泌TNF-α、IL-6、IL-12等促炎因子参与抗菌和抗肿瘤免疫，而M2型则通过分泌IL-10和TGF-β促进组织修复并抑制炎症。巨噬细胞在免疫监视、组织修复、炎症调节及免疫疾病中发挥多样作用，其功能和表型会根据局部微环境中的细胞因子和代谢状态发生变化。

Fig 1.Origin of tissue-resident macrophages: bone marrow-originated monocytes（10.1016/j.jconrel.2015.12.014）

巨噬细胞的分类仍然是一个备受争议的领域，不同因素如信号分子、生长因子、转录因子、表观遗传变化、转录后机制以及小生境信号（如细胞因子、细胞间接触和代谢物）都能导致巨噬细胞呈现不同的表型和活化状态。此外，面对微生物及其产物（如脂多糖LPS），巨噬细胞能够动态调节其活化状态。巨噬细胞活化在维持组织稳态以及调控炎症和疾病进程中起着至关重要的作用。

M1型巨噬细胞通常通过干扰素-γ和细菌脂多糖（LPS）进行活化，主要分泌促炎因子，在炎症的早期阶段发挥关键作用。相对而言，M2型巨噬细胞通过Th2细胞因子如IL-4、IL-13以及免疫复合物等激活，表达抗炎因子，起到抑制炎症反应和促进组织修复的作用。M2型巨噬细胞可进一步细分为三种亚型：M2a、M2b和M2c。M2a和M2b主要参与免疫调节和促进M2型免疫反应，而M2c则在抑制免疫反应和组织重构中发挥作用。

Fig 2.M1 and M2 macrophages in tumor regulation, with M1 inhibiting and M2 promoting tumor growth（10.1007/s00262-020-02781-8）

巨噬细胞流式检测操作步骤：

■样品准备
收集样本：
样品可以来源于组织（如脾脏、肺、肝脏等）或体液（如外周血、腹水、支气管肺泡灌洗液等）。
组织样品：使用机械解离或酶消化（如胶原酶、DNase）制备单细胞悬液。对于组织样本，建议先进行组织的研磨或机械破碎，然后通过酶消化获得单细胞。
血液样品：使用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。
细胞计数：
使用自动细胞计数器或手动血细胞计数板进行计数，调整细胞浓度为1-2 × 10^6 cells/mL，确保足够的细胞量进行后续抗体标记和分析。

■封闭非特异性结合
使用Fc受体阻断剂（如Mouse Anti-Mouse CD16/CD32，货号：FMK25210或Human Fc Receptor Blocking ），或使用正常血清（如5-10%正常山羊血清或牛血清）在冰上孵育10-15分钟，以封闭巨噬细胞上的Fc受体，减少抗体非特异性结合。

■抗体标记
选择抗体：
根据实验需求选择适合巨噬细胞表面和/或胞内标志物的荧光标记抗体。常用的巨噬细胞标志物包括：
表面标志物：F4/80、CD11b、CD68、CD163、CD206（M2型巨噬细胞标志）等。
活化状态标志物：CD80、CD86（M1型），或CD206、CD163（M2型）。
抗体孵育：
按照抗体说明书推荐的用量，将荧光标记抗体加入100 µL的细胞悬液中（通常1-5 µL/百万细胞）。
在冰上或4°C下避光孵育30分钟。
细胞洗涤：
用流式缓冲液（PBS + 2% FBS或BSA）洗涤细胞两次，每次离心300-400g，5分钟，弃去上清液。

■细胞染色（可选）
死细胞排除染色：
加入如7-AAD、PI或DAPI等死细胞排除染料，在抗体标记完成后染色，确保只分析活细胞，避免死细胞产生假阳性信号。
胞内标志物染色（可选）：
如需要检测胞内因子或标志物（如TNF-α、IL-10等），需对细胞进行固定和通透。
使用4%多聚甲醛固定细胞10-15分钟后，再使用通透液（如0.1% Triton X-100）处理。

■数据采集
流式细胞仪设定：
根据使用的荧光抗体选择适当的激光器和通道。常用的荧光染料包括FITC、PE、APC、PerCP等，确保染料的发射波长与仪器的检测通道相匹配。
样品上机：
将处理后的细胞悬液装入流式细胞仪采样管，开始数据采集。
采集细胞数：
通常采集10,000至100,000个细胞以确保结果的统计学有效性。

■数据分析
门控设定：
通过流式细胞仪软件（如FlowJo或FCS Express）分析数据。
根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图设置门限，以区分不同大小和颗粒度的细胞，并排除细胞碎片。
使用巨噬细胞特异性标志物（如F4/80、CD11b）进行初步门控，再根据M1或M2型标志物（如CD80、CD86、CD206）进行进一步分类。
补偿和对照：
设置适当的荧光补偿，减少不同荧光染料通道之间的信号重叠。确保使用单染色对照、未染色细胞作为阴性对照，以及同型对照进行信号验证。

■结果报告
数据输出：
生成散点图或直方图，以展示巨噬细胞亚群的比例和表型分布。
分析M1型和M2型巨噬细胞在样本中的比例及其活化状态，比较不同处理条件下巨噬细胞的功能和状态差异。

■注意事项
抗体孵育期间避免光照，确保荧光标记抗体不被降解。
设置适当的对照，包括同型对照、阴性对照、单染色对照，以确保数据准确性。
保持细胞悬浮状态，避免细胞团块形成影响数据质量。
合适的样本浓度：确保样本浓度适当，避免过度稀释或浓缩影响抗体结合效率。

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参考文献：

[1]Pei, Yihua, and Yoon Yeo. “Drug delivery to macrophages: Challenges and opportunities.” Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society vol. 240 (2016): 202-211. doi:10.1016/j.jconrel.2015.12.014