B细胞解决方案 B cell Panel

B细胞（又称B淋巴细胞）在适应性免疫反应中发挥重要作用，能够生成高亲和力抗体、建立免疫记忆、充当抗原呈递细胞，并分泌多种细胞因子，如CCL22、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α等。记忆B细胞和浆细胞则能产生免疫球蛋白（如IgM、IgG和IgE）。B细胞的发育始于骨髓中的造血干细胞（HSCs），在外周淋巴器官中通过抗原刺激成熟。成熟后，B细胞会增殖并分化为浆细胞，分泌抗体在血液中循环。虽然大多数B细胞寿命较短，但记忆B细胞可以长期存活，确保对未来感染的快速反应。

B细胞的发育经历多个阶段，主要在骨髓和外周淋巴器官中完成。

Fig 1.B-cell development and B-cell subsets

B细胞的命运由特定基因的活化与沉默精确调控，其发育状态可通过特异性表面和细胞内标志物的表达进行分析。大部分B细胞在骨髓中完成早期发育，随后迁移至次级淋巴器官（SLO）进行进一步分化成熟，最终进入血液循环。胚胎期，B细胞在胎儿肝脏中发育；出生后，B细胞主要在骨髓中发育，初步成熟后迁移至脾脏及其他次级淋巴组织，完成其功能性成熟。

Fig 2.B cell developmental stages in the bone marrow.（doi.org/10.7554/eLife.53557）

在B细胞发育和成熟的各个阶段，B 细胞表达出多个可用流式细胞术区分的标记物：CD19可以作为B细胞整体的标志物，该marker仅在最终的浆细胞阶段丢失。

人B细胞分型
B 细胞类型	标志物	来源
Pan B cells	CD19+, CD20+, CD22+, Ig-	外周血
Naive B cells	CD19+, CD20+, CD27-, CD22+, IgD+	外周血
Activated B cells	CD19+, CD20+, CD27+, CD30+, CD25+/-, CD69+, CD80/86+, IgM+, IgD+	外周血
Plasma cells	CD19low, CD20-, CD138+, CD38high, CD27+, MHC II +/-	外周血
Memory B cells	CD19+, CD20+, CD27+, CD38-, CD40+, CD23low, IgM/A/E/G+, IgD-	外周血
Abnormal B cells	CD19+, CD20+, ROR1+, CD5+, CD10+, Ig-	外周血
Pro B cells	CD10+, CD19+, CD34+, CD38+, CD24+, IgM-	骨髓
Pre and/or Immature B cells	CD19+, CD20+, CD34+, CD38+, CD24+, IgM+, IgD-	骨髓
Plasma cells (Bone marrow)	CD19low, CD20-, CD138+, CD38high, CD27+, MHC II +/-	骨髓
Abnormal CLL B cells	CD19+, CD20+, ROR1+, CD5+, Ig-	骨髓

小鼠B细胞分型
B 细胞类型	标志物	来源
Pro B cells	CD19+, CD43+, CD20+, CD24+, CD45R(B220)+, IgM-	小鼠骨髓
Pre B cells	CD19+, CD43low, CD20+, CD24+, CD25+, CD45R(B220)+, IgM-	小鼠骨髓
Immature B cells	CD19+, CD93+, CD20+, CD24+, CD45R(B220)+, IgM+, IgD-	小鼠骨髓
Plasmablasts	CD19+, CD138+, CD45R(B220)low, MHC class II-, IgM/A/E/G-	小鼠骨髓
Plasmacells	CD19+, CD138+, CD45R(B220)low, CD93+, MHC class II+, Ig-	小鼠骨髓
Abnormal B cells	CD19+, CD20+, CD5+, Ig-	小鼠骨髓
Transitional B cells	CD19+, CD24+, CD93+, CD45R(B220)+, IgMhigh, IgDlow	小鼠脾脏/淋巴组织
MZ and FOB cells	CD19+, CD21+, CD23+, CD45R(B220)+, IgM+, IgD+	小鼠脾脏/淋巴组织
Regulatory B cells	CD19+, CD25+, CD45R(B220)+, CD1d+, TGFβ+, IgM/D-	小鼠脾脏/淋巴组织
Germinal center cells	PNA+, CD19+, CD38low, CD93+, GL7+, IgM/A/E/G+	小鼠脾脏/淋巴组织
Plasmablasts (Spleen)	CD19+, CD138+, CD45R(B220)low, MHC class II-, IgM/A/E/G-	小鼠脾脏/淋巴组织
Plasma cells (Spleen)	CD19+, CD138+, CD45R(B220)low, CD93+, MHC class II+, Ig-	小鼠脾脏/淋巴组织
Memory B cells	CD19+, CD20+, CD27+, CD38-, CD40+, CD80+, IgM/A/E/G+	小鼠脾脏/淋巴组织
Pan B cells	CD19+, CD20+, CD45R(B220)+	小鼠脾脏/淋巴组织
B-1a cells	CD19+, CD20+, CD45R(B220)+, CD5+, IgM/D-	小鼠脾脏/淋巴组织
B-1b cells	CD19+, CD45R(B220)+, CD93-, CD23-, IgMhigh, IgDlow	小鼠脾脏/淋巴组织

B细胞分泌的细胞因子
Cell type	Cytokines Secreted
B effector 1 (Be-1)	IFN-γ, IL-12, TNF
B effector 2 (Be-2)	IL-2, IL-4, IL-6, TNF
Regulatory B	IL-10, TGF-β1

B细胞流式检测操作步骤：

■ 样品准备
收集样本：从血液、骨髓或淋巴组织中提取单细胞悬液。常见的样品来源包括外周血、脾脏、淋巴结等。
血液样品：用EDTA管收集外周血并进行红细胞裂解（红细胞裂解液如需稀释到工作浓度记得用蒸馏水或去离子水进行稀释，切记！！！）。
骨髓样品：直接收集骨髓细胞。
淋巴器官样品：机械或酶消化脾脏、淋巴结等，获取单细胞悬液。
细胞计数：使用血细胞计数器或自动细胞计数器进行细胞计数，以确保细胞浓度适合抗体标记，通常为1-2 x 10^6 cells/ml。
封闭非特异性结合：使用Fc受体阻断剂（Human Fc Receptor Blocking 或Purified Mouse Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse AS Fc Block™) (2.4G2)，货号：FMK25210）或5-10%正常血清（如牛血清、山羊血清等）在冰上孵育5-10分钟，以封闭Fc受体，防止非特异性抗体结合。

■抗体标记
选择抗体：根据需要选择针对B细胞的表面或细胞内标志物的荧光标记抗体。常用的B细胞标志物包括：
CD19、CD20：B细胞表面标志物
IgM、IgD：区分成熟和未成熟B细胞
CD27：记忆B细胞标志物
CD138：浆细胞标志物

抗体孵育：
按照实验方案，将荧光标记的抗体加入到细胞悬液中，通常抗体量为1-5 μl/抗体/百万细胞。
在冰上或4°C孵育20-30分钟，避免光照，以防荧光抗体降解。

细胞洗涤：
用流式缓冲液（PBS或PBS + 2% FBS）洗涤细胞，至少两次，以去除未结合的抗体。
在每次洗涤后，以300-400g离心5分钟，小心弃去上清。

■细胞染色（可选）
死细胞排除染色：使用死细胞染料（如7-AAD、PI或DAPI）来排除死细胞的干扰。在抗体标记完成后加入死细胞染料，避免死细胞产生假阳性信号。
细胞内染色（可选）：如果需要检测细胞内因子或蛋白质，需对细胞进行固定和透化。使用固定液（如4%多聚甲醛）将细胞固定10-15分钟。使用透化液（如Triton X-100）处理细胞，使抗体进入细胞内部。

■数据采集
仪器设定：根据所用的荧光抗体选择适当的激光器和通道：
FITC、PE、APC、PerCP等常用染料的激发和检测波长应根据流式仪器的配置进行选择。

样品上机：将处理后的样品装入流式细胞管，通过流式细胞仪采集数据。
采集细胞数：通常采集10,000-50,000个细胞，以保证统计学的有效性。

设定门控：
根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图，识别淋巴细胞群体。
根据CD19、CD20等B细胞表面标志物，设定进一步的门控。
对不同B细胞亚群，如浆细胞、记忆B细胞、活化B细胞等，进行更细致的门控。

■数据分析
流式数据分析：通过流式细胞分析软件（如FlowJo、FCS Express）分析采集到的数据。
设置门控策略：从总淋巴细胞中筛选出B细胞（如CD19+），进一步对不同B细胞亚群进行分析。
荧光补偿：使用适当的补偿调整，减少不同荧光通道之间的信号重叠。
结果呈现：生成散点图或直方图，计算各B细胞亚群的比例和荧光强度，定量分析B细胞的状态和功能。

■结果报告
结果解释：结合流式数据，分析B细胞的数量、比例以及不同亚群的状态。
数据输出：将分析结果以表格或图表的形式展示，便于进一步研究或报告。

流式产品推荐：

人B细胞流式抗体
Target	Clone number	CAT.	Species
CD5	5D7	FHC18820	Human
CD5	H65	FHC18810	Human
CD19	1D3	FHD10830	Human
CD21	HB5	FHD36810	Human
CD24	3B6	FHD65220	Human
CD27	5F24	FHD72221	Human
CD27	1F5	FHD72211	Human
CD69	SAA0031	FHG11610	Human
CD72	W004	FHD48310	Human
CD80(B7-1)	IDEC-114	FHE03410	Human
CD86	PMP2B10	FHE33810	Human
ROR1	R12	FHF90732	Human
CD138	SAA0055	FHD30813	Human

小鼠B细胞流式抗体
Target	Clone number	CAT.	Species
CD19	4G7	FMD10810	Mouse
CD20	18B12	FMC90710	Mouse
CD21	7G6	FMD36810	Mouse
CD40	FGK45	FMD68910	Mouse
CD80(B7-1)	16-10A1	FME03410	Mouse
CD86	GL1	FME33810	Mouse
ROR1	R11	FMF90712	Mouse

B细胞相关细胞因子
Catalog No	Product Name
YMB95401	Recombinant Mouse IFNG/IFN-gamma Protein, N-His
YHB95402	Recombinant Human IFNG/IFN-gamma Protein, N-His
EHJ93401	Recombinant Human IL12/IL12 p70/NKSF Protein, C-His & C-Strep
EMJ93401	Recombinant Mouse IL12/IL12 p70/NKSF Protein, C-His & C-Strep
YHB94401	Recombinant Human TNFa/TNF-alpha Protein, N-His
YMB94401	Recombinant Mouse TNFa/TNF-alpha Protein, N-His
EHC15803	Recombinant Human IL6 Protein, C-Fc
YMC15802	Recombinant Mouse IL6 Protein, C-Strep

参考文献：

[1]Monzón-Casanova, Elisa et al. “Polypyrimidine tract-binding proteins are essential for B cell development.” eLife vol. 9 e53557. 21 Feb. 2020, doi:10.7554/eLife.53557